Варианты гена KDM6B могут вносить вклад в развитие церебральной фолатной недостаточности у человека

Варианты гена KDM6B могут вносить вклад в развитие церебральной фолатной недостаточности у человека
авторы: Xiao Han, Xuanye Cao, Robert M. Cabrera, Paula Andrea Pimienta Ramirez, Cuilian Zhang, Vincent T. Ramaekers, Richard H. Finnell, Yunping Lei, пер. CopperKettle (Тимеев Артём Геннадьевич)

Оригинал: англ. KDM6B Variants May Contribute to the Pathophysiology of Human Cerebral Folate Deficiency. — Перевод созд.: 2022, опубл: 2022. Источник: мой перевод, 2023

Варианты гена KDM6B могут вносить вклад в развитие церебральной фолатной недостаточности у человека

Прочитать или скачать файл перевода в формате PDF на сайте Wikimedia Commons

Авторы: Сяо Хань ^1,2,†, Сюанье Цао ^2,†, Роберт М. Кабрера ², Паула Андреа Пимиента Рамирес ², Цуйлянь Чжан ¹, Винсент Рамакерс ³, Ричард Финнелл ^2,4,*, Юньпин Лэй ^2,*

1. Центр репродуктивной медицины, Народная больница провинции Хэнань, Народная больница при Университете города Чжэнчжоу, Чжэнчжоу, 450003, Китай.
2. Центр прецизионной гигиены окружающей среды, Кафедра молекулярной и клеточной биологии, Бэйлорский медицинский колледж, Хьюстон, TX 77030, США.
3. Отделение детской неврологии, Университетский больничный центр Льежа, 4000, Льеж, Бельгия
4. Кафедры молекулярной генетики, генетики человека и медицины, Бэйлорский медицинский колледж, Хьюстон, TX 77030, США
* Адреса для переписки: finnell@bcm.edu (автор R.H.F.); yunping.lei@bcm.edu (автор Y.L.)
† Указанные авторы внесли равный вклад в данную работу.

Формат цитирования статьи: Han, X.; Cao, X.; Cabrera, R.M.; Pimienta Ramirez, P.A.; Zhang, C.; Ramaekers, V.T.; Finnell, R.H.; Lei, Y. KDM6B Variants May Contribute to the Pathophysiology of Human Cerebral Folate Deficiency. Biology 2023, 12, 74. https://doi.org/10.3390/biology12010074

Рукопись получена: 24.11.22
Пересмотрена: 25.12.22
Принята: 30.12.22
Опубликована: 31.12.22
Русский перевод опубликован в Викитеке: 01.04.2023

Популярная аннотация

Согласно принятому определению, синдром церебральной фолатной недостаточности (ЦФН) – любое неврологическое состояние, при котором в спинномозговой жидкости наблюдаются сниженные концентрации 5-метилтетрагидрофолата. Проведенные ранее клинические исследования указывают на вклад мутаций гена фолатного рецептора альфа (FOLR1) в развитие ЦФН. В ходе нашей работы мы выявили шесть генетических вариантов гена, кодирующего лизин-специфическую гистоновую деметилазу 6B (KDM6B) у 48 пациентов с ЦФН. Мы показали, что эти варианты KDM6B снижают белковую экспрессию FOLR1, воздействуя на эпигенетические маркеры, которые регулируют организацию хроматиновых структур и экспрессию генов. Более того, в образцах сыворотки пациентов с ЦФН были обнаружены аутоантитела к белку FOLR1. Насколько нам известно, в настоящем исследовании KDM6B впервые упоминается как один из кандидатных генов, предположительно связанных с развитием ЦФН у человека.

Аннотация

(1) Актуальность: У большинства пациентов с ЦФН генетическая этиология заболевания остается недостаточно изученной. Ранее сообщалось о том, что варианты гена KDM6B вызывают расстройства нервно-психического развития; вместе с тем ассоциация гена KDM6B с церебральной фолатной недостаточностью была неизвестна; (2) Методы: В когорте из 48 изолированных случаев ЦФН было проведено экзомное секвенирование (ЭС). Была осуществлена in-vitro оценка воздействия вариантов гена KDM6B на экспрессию белка KDM6B, на наличие эпигенетической модификации гистона H3 по лизину 27, и на генетическую экспрессию FOLR1. У каждого пациента было проведено измерение титра аутоантител к FOLR1 в сыворотке; (3) Результаты: У пяти пациентов с ЦФН, составляющих 10% исследованной нами когорты лиц с ЦНФ, было выявлено шесть вариантов гена KDM6B. Согласно результатам функциональных экспериментов, данные варианты KDM6B продуцируют сниженные количества белка KDM6B, в результате чего повышается степень диметилирования H3K27me2, снижается степень ацетилирования H3K27Ac, снижаются концентрации белка FOLR1. Помимо этого, в сыворотке были обнаружены аутоантитела к FOLR1; (4) Заключение: Результаты позволяют предположить, что ген KDM6B является новым кандидатным геном церебральной фолатной недостаточности у человека. Варианты гена KDM6B могут приводить к снижению экспрессии гена FOLR1, а также вызывать предрасположенность к генерации аутоантител к FOLR1.

Ключевые слова: KDM6B; церебральная фолатная недостаточность; FOLR1; H3K27me2; H3K27Ac

1. Введение

Синдромом церебральной фолатной недостаточности (ЦФН, OMIM#: 613068) считается любое неврологическое состояние, при котором наблюдаются сниженные концентрации 5-метилтетрагидрофолата (5-MTHF) в спинномозговой жидкости (СМЖ) [1,2]. Клиническая картина при ЦФН разнообразна. С четырехмесячного возраста начинают отмечаться такие симптомы, как раздражительность и нарушения сна, за которыми часто следует развитие психомоторной заторможенности, дискинезии, мозжечковой атаксии и спастической диплегии. Другие симптомы включают в себя замедление роста окружности головы, нарушение зрения, и нейросенсорную тугоухость [3].

В организме человека концентрация фолата в спинномозговой жидкости превышает концентрацию в сыворотке крови в 1.5 – 3 раза, причем это отношение гораздо выше в младенческом возрасте и снижается до окончания подросткового возраста [4,5]. Фолат незаменим для нормального эмбрионального и последующего развития, а пренатальная и постнатальная фолатная недостаточность, особенно затрагивающая центральную нервную систему, как считается, вносит вклад в развитие разнообразных неврологических нарушений, в том числе умственной отсталости, эпилепсии, атаксии и пирамидных знаков [6,7]. Самым распространенным средством коррекции выявляемых случаев недостаточности является фолинат кальция, препарат фолиновой кислоты, при использовании которого было продемонстрировано некоторое снижение многих клинических симптомов и улучшение прогноза показателей дальнейшего развития и показателей неврологического исхода [8].

Было продемонстрировано несколько механизмов, участвующих в развитии церебральной фолатной недостаточности [3]. Вторичные формы церебральной фолатной недостаточности могут возникать из-за недостатка фолатов в диете, приема антифолатных препаратов, при печеночной недостаточности или целиакии [9]. Этиологическую связь с ЦФН также имеют некоторые редкие генетические заболевания, например, врожденная мальабсорбция фолатов, вызываемая мутациями гена SLC46A1 (альтернативные сокращения: PCFT, HCP, индекс в каталоге OMIM: 611672) [10], и недостаточность дигидрофолатредуктазы (DHFR, OMIM: 126060). Более того, широко признан вклад в развитие ЦФН вариаций гена фолатного рецептора FOLR1 (OMIM: 136430) [11,12]. Случаи ЦФН легкой-умеренной степеней тяжести у детей обычно объясняются нарушениями, вторичными по отношению к митохондриальным заболеваниям нескольких подтипов. Такие заболевания часто обнаруживаются у детей с дисфункцией различных органов, в том числе с неврологическими нарушениями. Вместе с тем при дебюте ЦФН в младенческом возрасте и среднем-тяжелом течении заболевания этиология в большинстве случаев состоит в наличии высоких титров аутоантител к фолатному рецептору альфа в сыворотке крови [7,13]. В этих случаях нарушение транспорта фолата через сосудистое сплетение приводит к развитию фолатной недостаточности, отмечаемой в спинномозговой жидкости и нервных тканях и способствующей неблагоприятному нервно-психическому развитию [1,14].

Лизин-деметилаза 6B (KDM6B, OMIM: 611577) представляет собой фермент, специфически осуществляющий деметелирование диметилированного либо триметилированного лизинового остатка 27 на гистоне H3 (H3K27me2 или H3K27me3) [15]. Метилирование в позиции H3K27 действует в качестве репрессивного эпигенетического маркера, влияющего на пространственную организацию хроматина и экспрессию генов [16]. Метилирование гистонов играет важную роль в нескольких различных по своему характеру биологических процессах. KDM6B вносит вклад в осуществление воспалительных реакций и в ряд иных биологических процессов разного плана, в том числе в стресс-индуцированную клеточную сенесценцию, в процессы развития и дифференциации клеток [17]. В 2019 году Stolerman et al [18] сообщили о 12 пациентах, у которых обнаруживались повреждающие de novo вариации гена KDM6B и наблюдались задержки в нервно-психическом развитии, сказывающиеся на развитии речи и двигательных навыков; проявления лицевого дисморфизма, включающие выдающуюся переносицу или нос и огрубление черт лица, а также широкие кисти рук и синдактилию. Вместе с тем было неизвестно, имелась ли у данных пациентов церебральная фолатная недостаточность.

В целях углубленного изучения генетической этиологии и механизмов развития ЦФН у человека мы в рамках настоящей работы проанализировали экзомные последовательности у 48 пациентов с ЦФН и выявили шесть редких миссенс-вариантов гена KDM6B. Мы также предприняли функциональный анализ, в ходе которого было показано, что миссенс-варианты гена KDM6B, выявленные у пациентов с ЦФН, приводят к снижению концентрации белка FOLR1 в клеточных линиях HeLa. Результаты последующих экспериментов указали на то, что мутантный ген KDM6B может регулировать уровни концентрации FOLR1 посредством повышения экспрессии H3K27me2 и понижения экспрессии H3K27Ac – эти изменения могут потенциально влиять на транскрипцию FOLR1. В целом полученные нами результаты являются первой демонстрацией того, что варианты гена KDM6B вносят вклад в развитие ЦФН у человека, и тем самым расширяют наше понимание этиологии этого недавно открытого состояния.

2. Материалы и методы

2.1. Соблюдение этических норм

Исследование было одобрено Экспертным комитетом организации при Бэйлорском медицинском колледже (номер решения: H-49549), а Комитет по этике при Больнице Льежского университета одобрил исследование решением под протоколом № FOL040113, зарегистрированным под бельгийским кодом B707201316427 (FAMHP: Федеральное агентство по лекарственным средствам и товарам медицинского назначения). Родители каждого пациента, включенного в исследование, подписали формы информированного согласия.

2.2. Субъекты исследования

Образцы геномной ДНК были собраны у 48 пациентов с ЦФН, клинические данные которых были представлены в нашей предыдущей работе [19]. Концентрация фолата в спинномозговой жидкости измерялась в больницах, в которых происходило лечение субъектов. В качестве контрольных данных были использованы результаты секвенирования гена KDM6B (NM_001080424.2) из базы данных gnomAD.

2.3. Анализ генетической последовательности

Процедуры экзомного секвенирования (ЭС) и анализа данных были описаны ранее [6]. Вкратце: библиотеки ДНК для секвенирования были созданы с помощью набора NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA). Экзомные участки были считаны с помощью Agilent SureSelect Human All Exon V5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Секвенирование библиотек осуществляли на платформе Illumina Hi-Seq 2000 (Illumina, San Diego, CA, USA). Данные в формате FASTQ, полученные при экзомном секвенировании, были картированы в hg19 с помощью программы BWA, проиндексированы с помощью SAMtools, рекалибровка качества оснований произведена с помощью GATK. Определение вариантов осуществляли с помощью GATK HaplotypeCaller по протоколу GATK Best Practice Protocol. Редкие патологические вариации были сгруппированы по генам. По числу патологических вариантов, выявленных у 48 пациентов с ЦФН, первое место занял ген KDM6B.

2.4. Плазмиды

Вектор pcDNA3.1+/C-(K)DYK и вектор pcDNA3.1+/C-(K)DYK-KDM6B были приобретены у компании Genscript. Плазмиды с мутантным KDM6B были произведены компанией Genescript на основе вектора «дикого типа» pcDNA3.1+/C-(K)DYK-KDM6B.

2.5. Клеточная культура и трансфекция

Клетки HeLa культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Dulbecco’s Modified Eagles Medium; DMEM, Sigma, St. Louis, MO, D6429, USA) с добавлением 10%-ной фетальной бычьей сыворотки, инактивированной нагреванием (FBS, Gibco, 26140079) и 1X раствора антибиотик/антимикотик (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, 15240-062, USA). Клеточные культуры выдерживали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. По достижении 50%-ной конфлюэнтности производили трансфекцию с помощью реактива Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, 11668019, USA) в соответствии с протоколом производителя. Перед трансфекцией среду заменяли на культуральную среду, не содержащую антибиотиков. Дальнейшие эксперименты производили через 48 часов после трансфекции.

2.6. Иммунофлюоресцентный анализ

Иммунофлюоресцентное окрашивание производили с целью выявления внутриклеточной локализации белка KDM6B «дикого типа» и мутантного белка KDM6B. Клетки HeLa засеивали в чашки диаметром 35 мм со стеклянным дном с плотностью высева 0.8 × 106 клеток на чашку и трансфецировали внесением 2 мкг плазмид с KDM6B «дикого типа» либо мутантным KDM6B по достижении 50%-ной конфлюэнтности на вторые сутки. Через 48 часов после трансфекции клетки фиксировали, помещая на 30 минут в 4% раствор параформальдегида, клеточные мембраны пермеабилизировали с использованием 0.3% Triton X-100 в TBST на протяжении 20 минут, а затем блокировали с использованием 10% нормальной козьей сыворотки (NGS) в трис-буферном физрастворе с 0.1% Tween® 20 Detergent (TBST) на протяжении 1 часа. Затем клетки инкубировали с антителом к FOLR1 (1:100, Proteintech, Rosemont, IL, USA, 23355-1-AP) и антителом к FLAG-тегу (1:1000, ThermoFisher Scientific, MA1-91878) в течение ночи при температуре 4°С. После инкубации клетки промывали натрий-фосфатным буфером (PBS) и инкубировали на протяжении 1 часа с вторичными антителами (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA, 8889S; 4408S) в защищенном от света месте. Для окрашивания ядер и защиты флуоресцентного белка от выцветания использовалась гистологическая среда с защитой от выцветания, содержащая 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (Anti-fade mountant by Invitrogen, Waltham, MA, USA, P36931). Для получения изображений использовалась деконволюционная микроскопия (Nikon T2).

2.7. Анализ методом вестерн-блот

Клетки HeLa засеивали в 6-луночный планшет с плотностью высева 0.8 × 106 клеток на лунку и трансфецировали внесением 2 мкг плазмид KDM6B мутантного и дикого типа по достижении 50%-ной конфлюэнтности на вторые сутки. Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и промывали ледяным натрий-фосфатным буфером, затем подвергали лизису на протяжении 20 минут, используя лизисный буфер для радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) с таблетками cOmplete™ ULTRA Tablets (Sigma, St. Louis, MO, USA). Лизаты центрифугировали на протяжении 20 минут при 12000 оборотах в минуту при температуре 4°C. Супернатанты переносили в новую пробирку и оценивали концентрацию белка с помощью набора Pierce™ BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). После выдерживания в кипящем буфере для образцов на протяжении 5 минут белки загружали в лунки (по 25 мкг в лунку) 4-15%-ного градиентного геля (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и осуществляли электрофорез на протяжении 90 минут под напряжением 120 В. Белки переносили из геля на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и блокировали с использованием 5% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) в TBST на протяжении 1 часа. Мембрану инкубировали с антителом к FLAG (1:1000, ThermoFisher Scientific, MA1-91878), антителом к FOLR1 (1:1000, Invitrogen, Waltham, MA, USA), антителом к H3K27me2 (1:500, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), антителом к H3K27Ac (1:500, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), антителом к гистону H3 (1:5000, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) и антителом к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе (GAPDH; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) на протяжении ночи при 4°C, а на второй день инкубировали с анти-мышиным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена и анти-кроличьим антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (1:5000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) на протяжении 1 часа. Мембрану инкубировали с субстратами усиленной хемилюминесценции (Enhanced Chemiluminescence, ECL) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Изображения получали с помощью системы BioRad ChemiDoc XRS Molecular Imager, а для количественного анализа изображений использовали программу Image J.

2.8. Аутоантитела к фолатному рецептору альфа (FOLR1)

Титр блокирующих аутоантител к FOLR1 в образце сыворотки каждого пациента измеряли в соответствии с ранее представленными методами [20]. 200 мкл сыворотки быстро подкисляли с использованием 300 мкл раствора, содержащего 0.1 М глицина, 0.5% Triton X-100 и 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), затем добавляли 12.5 мг покрытых декстраном угольных гранул для удаления свободного фолата из образца. После центрифугирования супернатант собирали и нейтрализировали, используя 40 мкл 1 М гидрофосфата натрия. Обработанный образец сыворотки инкубировали в течение ночи с апо-фолатным рецептором (apo-FR), выделенным из молока человека. На следующий день к образцу добавляли меченую тритием [3H] фолиевую кислоту (Moravek Inc., Brea, CA, USA, MT-783) и выдерживали образец 20 минут при комнатной температуре. Свободный [3H] удаляли, используя покрытые декстраном угольные гранулы. В супернатанте измеряли уровень радиоактивности, связанной с рецептором. Блокирующие аутоантитела предотвращают связывание [3H]-меченой фолиевой кислоты с FOLR1. Титр аутоантител выражали в пикомолях заблокированного рецептора FOLR1 на миллилитр сыворотки.

2.9. Статистический анализ

Все данные были проанализированы с использованием двухвыборочного t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали результаты с p-значениями менее 0.05. Данные представляли в формате «среднее ± стандартная ошибка среднего».

3. Результаты

3.1. Редкие миссенс-варианты гена KDM6B вносят вклад в развитие церебральной фолатной недостаточности у человека

Секвенирование экзома осуществляли с использованием образцов ДНК, собранных у 48 пациентов со спорадически-возникшей церебральной фолатной недостаточностью. В генах, кандидатных для церебральной фолатной недостаточности (FOLR1, PCFT, DHFR, CIC), не было выявлено ранее описанных в литературе редких миссенс-вариантов. Пользуясь критериями отбора, описанными выше, мы выявили у наших пациентов со спорадическим заболеванием 23 гена с частотой минорной аллели >0.05 и сочли их потенциально обогащенными генами. После валидации с помощью утилиты Bamcheck и применения точного теста Фишера мы установили, что лишь один ген был сильно обогащен в данной когорте пациентов с церебральной фолатной недостаточностью по сравнению с публично доступным набором данных, и этим геном являлся KDM6B. Было выявлено 7 подозрительных аллелей из 96 (7 аллелей у 48 пациентов), в то время как среди более чем 250 000 аллелей, описанных в базе данных gnomAD, миссенсными были 5625 аллелей (p = 0.0068). Согласно анализу в программе SIFT, все шесть вариантов должны иметь вредные последствия, и, следовательно, скорее всего являются патогенными. Была отмечена высокая (>80%) консервативность четырех вариантов из шести у множества видов млекопитающих (рисунок 1). В отношении варианта KDM6B p.Thr321Ala (c.A961G) не были доступны для анализа образцы материнской либо отцовской ДНК. В отношении пациента с вариантом KDM6B p.Ser826Tyr не было в наличии образца материнской ДНК. В случае с остальными четырьмя вариантами гена KDM6B, в отношении которых имелись образцы как материнской, так и отцовской ДНК, секвенирование по Сэнгеру показало, что все варианты были унаследованы либо от матери, либо от отца пациента (дополнительный рисунок S1). Согласно результатам секвенирования, пациент №1 является носителем биаллельного сочетания мутаций гена KDM6B, при котором вариант p.Thr761Ser унаследован от отца, а вариант p.Arg1016Gln – от матери.

Рисунок 1. Консервативность аминокислотной последовательности выявленных вариантов KDM6B у различных видов. Для сравнительного анализа в программе BLAST были взяты аминокислотные последовательности KDM6B человека, шимпанзе, собаки, коровы, мыши и крысы.

3.2. Клинические особенности пациентов с церебральной фолатной недостаточностью и вариациями гена KDM6B

Сводка клинических данных представлена в таблице 1. У всех пациентов наблюдалась тяжелая психомоторная заторможенность, сопровождавшаяся регрессией навыков у двух пациентов, а также задержка речевого развития. У пациентов 1 и 5 имелся диагноз расстройства аутистического спектра. Дисморфические черты наблюдались у пациентов 4 и 5. Факт усугубления неврологической картины по мере взросления соответствовал описанию клинических признаков, характерных для церебральной фолатной недостаточности с дебютом в младенческом возрасте, при этом у всех пациентов отмечались низкие концентрации фолата в спинномозговой жидкости. Вместе с тем спинномозговой жидкости наблюдались нормальные уровни моноаминовых метаболитов и птеринов. У всех пяти пациентов, являвшихся носителями миссенс-вариантов гена KDM6B, уровни гомоцистеина в образцах плазмы были в пределах нормы. У всех, за исключением пациента №3, в сыворотке наблюдался положительный титр аутоантител к фолатному рецептору альфа. У сиблингов №2 и №3 были также выявлены сложный гетерозиготный (пациент 2, EARS2: c.C322T, p.R108W, rs376103091 и c.1194C>G, p.Y398X, rs369291371) и гетерозиготный (пациент 3, EARS2: c.C322T, p.R108W, rs376103091) варианты гена EARS2, что, возможно, частично внесло вклад в снижение уровней фолата в спинномозговой жидкости. Несмотря на назначение фолиновой кислоты, клинический исход был неудовлетворителен у всех пациентов. Терапия фолиновой кислотой принесла наибольшие улучшения пациенту №1, причем стоит заметить, что пациент начал получать препарат в раннем возрасте, 2.5 месяцев, что демонстрирует важность раннего генетического тестирования и назначения терапии восстановленными формами фолата.

Tаблица 1. Клинические показатели пациентов с вариациями гена KDM6B

Показатели	Пациент 1 *	Пациент 2	Пациент 3 **	Пациент 4 ***	Пациент 5
Пол	Ж	М	Ж	Ж	Ж
Возраст (лет, при осмотре)	¼	5 ½	4	11 ½	11
Вариант гена KDM6B	c.C2282G p.T761S; c.G3047A p.R1016Q	c.C2722T p.R908C	c.C2722T p.R908C	c.C2477A p.S826Y	c.C1991T p.P664L
Беременность	Эпилепсия, терапия вальпроевойb + фолиевойc к-той	Без отклонений	Без отклонений	Н/Да	Преэклампсия
Параметры развития (процентили) Рост Вес Окружность головы	75–90-й 75-й 50–70-й	3й 3й 3й	25й 25й <3й	3й <3й <3й	нет данных нет данных 50-й
Черты дисморфизма	Отсутствуют	Отсутствуют	Отсутствуют	Грубые черты лица	Дисморфизм лица; стеноз пульмонарного клапана
Неврологические признаки ° Беспокойство, бессонница	+ -	+ +	- +	+ +	+ Н/Д
° Замедление роста головы ° Задержка и регрессия психомоторного развития ° Гипотонус и атаксия ° Пирамидная недостаточность ° Дискинезии (хорея, атетоз) ° Эпилепсия	+ - + - - -	+ + + + - +	- + - - + В 9 мес.** Эпистат. и печен. недостат.	+ - - - - +	+ + - - - +
Когнитивные функции ° Задержки в языковом развитии ° Умственная отсталость	- -	+ +	+ +	+ +	+ +
Расстройство аутистического спектра	+	-	-	-	+
Результаты сканирования мозга	Без отклонений	Лейкоэнцефалоп. с пораж. таламуса и ствола мозга и повыш. лактатомd; Частичн. реверсия изменений в белом в-ве	Прогрессирующая кортикальная/мозжечковая атрофия	Подкорковые очаги поражения белого вещества	Н/Д
Фолат в ликворе (нмоль/л)	14	24	38	30	34
% от нижн. значения референс. диапазона в СМЖ	22,2%	58,5%	60,3%	73,2%	83%
Аутоантитела к FRa в сыворотке	+	+	-	+	+
Начало терапии фолиновой кислотой	2 ½ месяца	5 лет	3 ½ лет	11 ½ месяцев	Без терапии

* Пациент 1. У брата и матери пациентки была обнаружена мутация в гене NFκB1.
** Пациентка №3 (младшая сестра пациента №2) развивалась нормально до 9-месячного возраста, после чего у неё развился тяжелый эпилептический статус с транзиентной печёночной недостаточностью, гипогликемией и лактатацидозом. Для купирования судорог использовался клоназепам, вальпроевая кислота и фенобарбитон. После этого эпизода у пациентки появилась раздражительность, было отмечено замедление роста окружности головы, хореические движения и снижение мыслительных способностей. МРТ-сканирование выявило прогрессирующую атрофию мозжечка и коры мозга. Анализ гена POLG1 позволил исключить наличие синдрома Альперса.
*** В геноме пациента №4 была выявлена дупликация в хромосомной области 7q31.32-q32.3.
° У всех пациентов были снижены уровни 5-метилтетрагидрофолата в спинномозговой жидкости. Референсный диапазон для здоровых лиц в возрасте от 0 до 4 лет составляет 63-111 нмоль/л; 5-16 лет: 41-117 нмоль/л. Пациенты №1 – 4 получали фолиновую кислоту, в то время как у пациента №5 повторная спинальная пункция выявила нормальную концентрацию фолата в спинномозговой жидкости.
Сокращения: a) Н/Д - данные недоступны; b) ВПК - вальпроевая кислота; c) ФК - фолиевая кислота; d) LTBL - лейкоэнцефалопатия с поражением таламуса и ствола мозга и повышенным лактатом.

3.3. Миссенс-варианты гена KDM6B изменяют экспрессию белка, не оказывая влияния на его локализацию

Мы осуществили функциональный анализ выявленных шести вариантов гена KDM6B для того, чтобы определить, какое воздействие они оказывают на экспрессию и локализацию белка. Ожидалось, что местом локализации белка KDM6B окажется клеточное ядро. Как показано на рисунке 2A, как белок KDM6B дикого типа, так и белок KDM6B мутантного типа, меченый FLAG-тегом, располагаются внутри ядра клетки, следовательно, варианты гена не повлияли на внутриклеточную локализацию белка. В отношении некоторых мутантных вариантов KDM6B было отмечено снижение флуоресцентного сигнала, в связи с чем мы предположили, что варианты гена KDM6B могут сказываться на экспрессии белка. После этого был осуществлен Вестерн-блот, показавший значительное снижение концентрации FLAG-меченых мутантных белков KDM6B всех шести вариантов по сравнению с белком дикого типа (p < 0.01) (рисунок 2B, C), что указывает на то, что данные миссенс-варианты гена KDM6B могут снижать белковую экспрессию KDM6B либо потенциально сказываться на концентрации белка.

Рисунок 2. Внутриклеточная локализация и концентрация белка KDM6B дикого типа и KDM6B мутантного типа. (A) Клетки HeLa трансфецировали на протяжении 36 часов с использованием конструктов, состоящих из FLAG-меченого белка KDM6B мутантного или дикого типа и вектора на основе pcDNA3.1. Съемку производили с использованием деконволюционной микроскопии. Масштабная метка 5 мкм. (B) Вестерн-блот осуществляли с использованием клеток HeLa через 48 часов после трансфекции. Для контроля нанесения образцов использовали GAPDH. (C) Процедуру Вестерн-блот повторяли трижды, затем рассчитывали t-критерий Стьюдента для сравнения концентрации белка дикого типа и мутантного типа. Оценка значимости при сравнении с клетками дикого типа: “a” для p < 0.001; “b” для p < 0.01.

3.4. Миссенс-варианты KDM6B снижают уровень белка FOLR1

Как показывают исследования, рецептор FOLR1 играет важную роль в захвате фолатов клетками и незаменимую роль в процессе развития нервной системы. Проведенные ранее генетические исследования показали, что варианты FOLR1 с потерей функции вносят вклад в развитие церебральной фолатной недостаточности [11]. Мы начали с оценки возможного влияния вариантов KDM6B на уровни белка FOLR1. Как показано на рисунке 3A, B, при использовании FLAG-меченого белка KDM6B дикого типа наблюдается более высокая концентрация белка FOLR1, чем в контрольных клетках (p < 0.05), а при избыточной экспрессии каждого из шести мутантных FLAG-меченых вариантов KDM6B наблюдается значительное снижение экспрессии белка FOLR1 по сравнению с экспрессией при использовании FLAG-меченого KDM6B дикого типа (p < 0.001).

Рисунок 3. Избыточная экспрессия мутантных вариантов KDM6B повлияла на концентрацию белка FOLR1 и на захват фолата клетками HeLa. (A) Клетки HeLa трансфецировали на протяжении 48 часов с использованием конструктов, состоящих из FLAG-меченого белка KDM6B мутантного или дикого (WT) типа и вектора на основе pcDNA3.1, после чего осуществляли Вестерн-блот для оценки концентрации белка FOLR1 в каждой группе клеток. Для контроля нанесения образцов использовали GAPDH. (B) Процедуру Вестерн-блот повторяли трижды, затем рассчитывали t-критерий Стьюдента для сравнения концентрации белка в клетках дикого типа и мутантных клетках. Оценка значимости при сравнении с клетками дикого типа (WT): “a” для p < 0.001; “c” для p < 0.05.

3.5. Миссенс-варианты KDM6B повысили экспрессию H3K27me2 и снизили экспрессию H3K27Ac

Известно, что KDM6B играет роль в деметилировании H3K27Me3/2. Исходя из этого, мы изучили возможное воздействие вариантов KDM6B на деметилирующую активность белка. Мы начали с измерения уровней белка H3K27me2, представляющего собой доминирующую модифицированную форму белка, в клетках с избыточной экспрессией KDM6B мутантного либо дикого типа. Как показано на рисунке 4, уровни белка H3K27me2 в клетках с KDM6B дикого типа были значительно ниже, чем уровни в клетках с контрольным вектором pcDNA3.1, в то время как все шесть вариантов KDM6B привели к значительному увеличению уровней H3K27me2 по сравнению с KDM6B дикого типа, свидетельствуя о том, что KDM6B стал хуже выполнять свою функцию лизин-специфичной деметилазы, либо снизилась экспрессия самого KDM6B. В литературе сообщалось об антагонистичном отношении процессов метилирования и ацетилирования лизинового остатка 27 на гистоне H3 [21]. Как показано на рисунке 4, при использовании KDM6B дикого типа уровни белка H3K27Ac были значительно выше, чем при использовании контрольной конструкции, в то время как у всех клеток, трансфецированных мутантными вариантами KDM6B, уровни H3K27Ac были ниже, чем при использовании KDM6B дикого типа. Результаты измерений наглядно показывают, что уровни белка H3K27Ac и активности H3K27me2 в каждой группе изменялись в практически противоположных направлениях.

Рисунок 4. Избыточная экспрессия мутантных вариантов KDM6B сказалась на метилировании и ацетилировании H3K27 в клетках HeLa. (A) Клетки HeLa трансфецировали на протяжении 48 часов с использованием конструктов, состоящих из FLAG-меченого белка KDM6B мутантного или дикого (WT) типа и вектора на основе pcDNA3.1, после чего осуществляли Вестерн-блот для оценки концентрации белка H3K27me2 и H3K27Ac в каждой группе клеток. Для контроля нанесения образцов использовали H3. (B, C) Процедуру Вестерн-блот повторяли трижды, затем рассчитывали t-критерий Стьюдента для сравнения концентрации белков H3K27me2 и H3K27Ac в клетках дикого типа и мутантных клетках. Оценка значимости при сравнении с клетками дикого типа (WT): “a” для p < 0.001; “b” для p < 0.01; “c” для p < 0.05.

4. Обсуждение

В ходе исследования мы произвели первый генетический анализ ассоциации гена KDM6B с церебральной фолатной недостаточностью и выявили шесть вариантов гена KDM6B, каждый с предсказанным патологическим воздействием, у 48 пациентов со спорадической ЦФН. Один из пациентов был носителем биаллельной вариации KDM6B (p.Thr761Ser и p.Arg1016Gln), и у него были отмечены самые низкие значения концентрации фолата в СМЖ среди пяти пациентов, что указывает на возможный аддитивный характер генетической ассоциации KDM6B с церебральной фолатной недостаточностью. Два пациента являлись сиблингами, и у каждого из них был выявлен вариант p.Arg908Cys гена KDM6B, унаследованный от их отца. Все варианты, выявленные в нашей когорте пациентов с ЦФН, представляли собой миссенс-варианты, и большинство из них, согласно имеющимся данным, были унаследованы от родителей, в то время как в изученной авторами Stolerman et al когорте пациентов с задержкой нервно-психического развития рассматривались de novo несинонимичные варианты, в том числе миссенсные мутации, вставочные сдвиги рамки считывания, и stop-gain вариации. Известно, что примерно у 80% пациентов с ЦФН отмечаются задержки нервно-психического развития. В нашем исследовании у всех пятерых носителей вариаций гена KDM6B были выявлены отклонения нервно-психического развития, в том числе аутизм, задержка языкового развития, и умственная отсталость. Неизвестно, страдали ли церебральной фолатной недостаточностью пациенты, изученные группой Stolerman et al в их исследовании мутаций гена KDM6B. Результаты исследований KDM6B, осуществленных нами и группой Stolerman et al., указывают на то, что вариации гена KDM6B, вызывающие потерю функции, могут приводить к нарушениям нервно-психического развития. Некоторые из родителей являлись гетерозиготными носителями миссенс-вариантов KDM6B, однако у них не наблюдалось каких-либо фенотипических проявлений, ассоциированных с церебральной фолатной недостаточностью; из этого мы сделали вывод, что редкой единичной гетерозиготной миссенс-вариации KDM6B может быть недостаточно для возникновения ЦФН. Вместе с тем, взаимодействие подобных вариантов с иными генетическими факторами (например, взаимодействие KDM6B p.R908C и EARS2 p.R108W у пациента №3) и/или факторами внешней среды, либо же наличие биаллельных вариантов KDM6B (например, KDM6B p.T761S и KDM6B p.R1016Q у пациента №1) может оказаться достаточным для возникновения фенотипа, свойственного синдрому церебральной фолатной недостаточности.

Мы также поставили дополнительные эксперименты в попытке понять скрытые механизмы, посредством которых KDM6B может вносить вклад в этиологию церебральной фолатной недостаточности. В число наиболее распространенных первичных причин ЦФН входят нарушения функции FOLR1 и высокие титры аутоантител к FOLR1 в сыворотке крови [22,23]. Как и Slc46a1, FOLR1 высоко экспрессирован в клетках сосудистого сплетения [24] и опосредует перенос фолата через сосудистое сплетение в спинномозговую жидкость. Сниженная экспрессия FOLR1 приводит к недостатку фолата в спинномозговой жидкости, при этом задержку дебюта заболевания принято объяснять тем, что на ранней стадии развития FOLR2 обеспечивает транспорт 5-MTHF, компенсируя недостаток FOLR1 [1]. В ходе настоящего исследования у носителей вариаций KDM6B не было выявлено вариаций генов FOLR1 либо FOLR2. В ходе экспериментов, осуществленных in vitro, мы установили, что, в согласии с белковыми уровнями KDM6B, белковые уровни FOLR1 в клетках HeLa с избыточной экспрессией KDM6B дикого типа были повышены по сравнению с уровнями в контрольных клетках, в то время как уровни FOLR1 в клетках, трансфецированных каждым из шести вариантов KDM6B, были значительно ниже, чем в клетках с KDM6B дикого типа.

Метилирование H3K27 часто связывают с репрессией генов [25], и этот процесс играет важную роль в самообновлении эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), их дифференциации и динамическом развитии [15,26,27]. В ходе исследования мы также отметили, что нарушение работы либо снижение экспрессии белка KDM6B приводит к повышению H3K27me2, и, как следствие, белковые концентрации H3K27Ac и H3K27me2 изменяются в обратных направлениях, что согласуется с данными литературы. Ацетилированный участок H3K27ac широко известен как маркер активных энхансеров и промоторов, и его наличие в сильной степени коррелирует с экспрессией генов и связыванием факторов транскрипции [28]. Группа Sarah et al. осуществила ассоциативное исследование с полным охватом гистонового ацетилома, в результате чего у пациентов с болезнью Альцгеймера в энторинальной коре были выявлены отличия в экспрессии H3K27ac, ассоциированные с заболеванием [29]. В проведенных ранее исследованиях также было показано, что фолиевая кислота и фолатные рецепторы (FOLR) играют важную роль в снижении концентрации гомоцистеина, представляющего собой фактор риска болезни Альцгеймера [30], и, учитывая полученные нами результаты, мы предполагаем, что сниженные уровни белка FOLR1 в клетках с выявленными вариациями KDM6B могут быть следствием сниженного количества участков H3K27Ac, поскольку это может нарушать транскрипцию FOLR1 (дополнительный рисунок S2).

Мы обнаружили у 80% (4/5) пациентов, гетерозиготных по выявленным вариантам KDM6B, повышенные титры аутоантител к FOLR1. Такие антитела, согласно распространенному мнению, вносят вклад в развитие церебральной фолатной недостаточности. Вызывает затруднение вопрос, каким был относительный вклад аутоантител к FOLR1 в развитие ЦФН у пациентов в настоящем исследовании, и каким был относительный вклад вариантов KDM6B. Тем не менее, согласно сообщениям в научной литературе, деметилазы лизина-27 на гистоне H3 (KDM6B, KDM6A) необходимы для дифференциации T-лимфоцитов посредством регулировки сигнальной оси Jmjd3-Irf4 [31,32,33]. В осуществленных недавно исследованиях было обнаружено, что KDM6B играет важную роль в аутоиммунных реакциях. Используя мышей, у которых Kdm6b отсутствовал, группа Liu et al. обнаружила, что Kdm6b играет незаменимую роль в поддержании гомеостаза мозгового вещества тимуса на послеродовой стадии, поддерживая выживаемость эпителиальных клеток мозгового вещества тимуса (mTEC-клеток) и регулируя экспрессию генов, кодирующих тканеспецифические антигены. У мышей линии BALB/c nude, которым трансплантировали тимус с нокаутом Kdm6b-/-, в ряде типов ткани обнаруживались воспалительные инфильтраты, что представляло собой непосредственную демонстрацию того, что недостаточность Kdm6b может провоцировать аутоиммунную реакцию [34]. На этом основании мы подозреваем, что у субъектов нашего исследования вариации KDM6B привели к генерации аутоантител к FOLR1, что, в свою очередь, внесло вклад в развитие фенотипа церебральной фолатной недостаточности, вкупе со снижением экспрессии FOLR1, вызванным этими вариациями KDM6B. Впрочем, эта гипотеза должна быть подвержена более серьезной проверке.

Мы также исследовали остальных членов когорты на наличие аутоантител и обнаружили, что положительный титр аутоантител присутствовал более чем у 89% пациентов с церебральной фолатной недостаточностью [22]. Общей для пациентов фенотипической чертой была сниженная концентрация фолата в спинномозговой жидкости. Общие для пациентов нарушения также включали аутизм, умственную отсталость, и задержку языкового развития. Учитывая то, что в регулировке процессов развития нервной системы и аутоиммунных реакций могут быть задействованы тысяч генов, и каждый человек может быть носителем различных генетических вариаций, влияющих на тот или иной аспект нейронального развития, неудивительно, что клинические признаки разнились от пациента к пациенту. Мы заняты изучением иных генов, способных вносить вклад в генерацию аутоантител к FOLR1 и в развитие фенотипов церебральной фолатной недостаточности.

По имеющимся сведениям, мы первыми представляем сообщение об ассоциации вариантов KDM6B с синдромом церебральной фолатной недостаточности у человека, и проведенные нами функциональные исследования показывают, что варианты KDM6B, ассоциированные с ЦФН, оказывают влияние на концентрацию белка FOLR1. Уровни метилирования в позиции H3K27 также оказались изменены под воздействием вариантов KDM6B, ассоциированных с ЦФН. Необходимо проведение дополнительных исследований для того, чтобы лучше разобраться в базовых патофизиологических механизмах, расширить наше понимание этиологии церебральной фолатной недостаточности, и создать теоретическую основу для терапии этой группы инвалидизирующих расстройств нервно-психического развития.

5. Заключение

В ходе настоящего исследования мы выявили шесть вариантов гена KDM6B в группе из 48 пациентов с церебральной фолатной недостаточностью. Мы также осуществили несколько функциональных экспериментов и определили, что данные варианты KDM6B продуцируют сниженные количества белка KDM6B, в результате чего повышается уровень H3K27me2, снижается уровень H3K27Ac, и падают концентрации белка FOLR1. Помимо этого, в сыворотке пациентов были обнаружены аутоантитела к FOLR1. Насколько нам известно, это первое исследование, в котором KDM6B описывается как возможный новый кандидатный ген, связанный с церебральной фолатной недостаточностью у человека. Полученные нами результаты приведут к лучшему пониманию новых механизмов развития церебральной фолатной недостаточности.

Дополнительные материалы: Указанные ниже дополнительные материалы могут быть скачаны по ссылке: https://www.mdpi.com/article/10.3390/biology12010074/s1 Рисунок S1: ДНК-секвенирование вариантов KDM6B у пациентов/родителей по методу Сэнгера; Рисунок S2: Диаграмма миссенс-вариантов гена KDM6B, вносящих вклад в развитие церебральной фолатной недостаточности.

Вклад авторов: Концептуализация - авторы R.H.F. и Y.L.; методология - X.H., Y.L., V.T.R. и C.Z.; программное обеспечение - X.C. и X.H.; валидация - X.H. и P.A.P.R.; формальный анализ - X.H. и Y.L.; исследование - X.H., X.C., Y.L., V.T.R. и C.Z.; ресурсы - R.H.F., V.T.R. и Y.L.; курирование данных - X.H., Y.L. и V.T.R.; написание статьи: составление первого черновика - X.H., Y.L. и X.C.; написание статьи: вычитка и редактирование - X.H., R.M.C., P.A.P.R., C.Z., V.T.R., R.H.F. и Y.L.; визуализация - X.H. и V.T.R.; супервизия - V.T.R. и Y.L.; администрирование проекта - R.H.F. и Y.L.; обеспечение финансирования - R.H.F. и Y.L. Все авторы ознакомились с опубликованной версией рукописи и одобрили её.

Сообщение о финансировании: Часть стоимости проекта была покрыта за счет грантов R01 HD081216 и HD100535, выделенных Национальными Институтами Здравоохранения США авторам R.H.F. и Y.L., и гранта R01 HD100229, выделенного автору R.M.C. Автор R.H.F. получает финансовую поддержку из средств, выделенных при создании именной профессуры для выдающихся профессоров имени Уильяма Т. Батлера при Бэйлорском медицинском колледже.

Заявление экспертного совета организации: Проведение исследования было одобрено решением Комитета по этике при Больнице Льежского университета (протокол FOL040113, зарегистрирован под бельгийским номером B707201316427), а также Экспертным советом при Бэйлорском медицинском колледже, решением под номером H-47187.

Заявление об информированном согласии: Информирование согласие было получено у всех субъектов, включенных в исследование. В целях публикации статьи было получено письменное информированное согласие от родителей пациентов.

Заявление о доступности данных: Полученные в ходе вторичных анализов данные, которые имеют отношение к отдельным генетическим вариантам и на которых основываются выводы, сделанные в настоящем исследовании, доступны по запросу, направлять который следует автору, ответственному за переписку – R.H.F. Анонимизированные данные будут доступны по запросу.

Благодарности: Благодарим Сюэ Гу за её помощь в завершении рукописи. Авторы выражают благодарность Техасскому центру перспективной вычислительной техники (Texas Advanced Computing Center, TACC) при Техасском университете в Остине за предоставленные высокопроизводительные вычислительные ресурсы (High-Performance Computing, HPC resources), поспособствовавшие получению результатов, изложенных в настоящей публикации. URL: http://www.tacc.utexas.edu. (доступ осуществлялся 7 января 2020 и 28 октября 2021).

Конфликты интересов: Авторы R.H.F. и R.M.C. ранее состояли в руководстве компании TeratOmics Consulting LLC., ныне не существующей. Автор R.H.F. также получает средства на оплату поездок, необходимых для посещения собраний редакционной коллегии журнала Reproductive and Developmental Medicine.

Список литературы

1. Molero-Luis M., Serrano M., O’Callaghan M.M., Sierra C., Pérez-Dueñas B., Garcia-Cazorla A., Artuch R. Clinical, etiological and therapeutic aspects of cerebral folate deficiency. Expert Rev. Neurother. 2015;15:793–802. doi: 10.1586/14737175.2015.1055322. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
2. Ramaekers V.T., Blau N. Cerebral folate deficiency. Dev. Med. Child Neurol. 2004;46:843–851. doi: 10.1111/j.1469-8749.2004.tb00451.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
3. Hyland K., Shoffner J., Heales S.J. Cerebral folate deficiency. J. Inherit. Metab. Dis. 2010;33:563–570. doi: 10.1007/s10545-010-9159-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
4. Spector R., Johanson C.E. Vectorial ligand transport through mammalian choroid plexus. Pharm. Res. 2010;27:2054–2062. doi: 10.1007/s11095-010-0162-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
5. Stover P.J., Durga J., Field M.S. Folate nutrition and blood–Brain barrier dysfunction. Curr. Opin. Biotechnol. 2017;44:146–152. doi: 10.1016/j.copbio.2017.01.006. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
6. Cao X., Wolf A., Kim S.-E., Cabrera R.M., Wlodarczyk B.J., Zhu H., Parker M., Lin Y., Steele J.W., Han X., et al. CIC de novo loss of function variants contribute to cerebral folate deficiency by downregulating FOLR1 expression. J. Med. Genet. 2020;58:484–494. doi: 10.1136/jmedgenet-2020-106987. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
7. Mangold S., Blau N., Opladen T., Steinfeld R., Weßling B., Zerres K., Häusler M. Cerebral folate deficiency: A neurometabolic syndrome? Mol. Genet. Metab. 2011;104:369–372. doi: 10.1016/j.ymgme.2011.06.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
8. Moretti P., Sahoo T., Hyland K., Bottiglieri T., Peters S., Del Gaudio D., Roa B., Curry S., Zhu H., Finnell R., et al. Cerebral folate deficiency with developmental delay, autism, and response to folinic acid. Neurology. 2005;64:1088–1090. doi: 10.1212/01.WNL.0000154641.08211.B7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
9. Djukic A. Folate-responsive neurologic diseases. Pediatr. Neurol. 2007;37:387–397. doi: 10.1016/j.pediatrneurol.2007.09.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
10. Qiu A., Jansen M., Sakaris A., Min S.H., Chattopadhyay S., Tsai E., Sandoval C., Zhao R., Akabas M.H., Goldman I.D. Identification of an intestinal folate transporter and the molecular basis for hereditary folate malabsorption. Cell. 2006;127:917–928. doi: 10.1016/j.cell.2006.09.041. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
11. Grapp M., Just I.A., Linnankivi T., Wolf P., Lücke T., Häusler M., Gärtner J., Steinfeld R. Molecular characterization of folate receptor 1 mutations delineates cerebral folate transport deficiency. Brain. 2012;135:2022–2031. doi: 10.1093/brain/aws122. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
12. Steinfeld R., Grapp M., Kraetzner R., Dreha-Kulaczewski S., Helms G., Dechent P., Wevers R., Grosso S., Gärtner J. Folate receptor alpha defect causes cerebral folate transport deficiency: A treatable neurodegenerative disorder associated with disturbed myelin metabolism. Am. J. Hum. Genet. 2009;85:354–363. doi: 10.1016/j.ajhg.2009.08.005. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
13. Pérez-Duenas B., Ormazábal A., Toma C., Torrico B., Cormand B., Serrano M., Sierra C., De Grandis E., Marfa M.P., García-Cazorla A., et al. Cerebral folate deficiency syndromes in childhood: Clinical, analytical, and etiologic aspects. Arch. Neurol. 2011;68:615–621. doi: 10.1001/archneurol.2011.80. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
14. Opladen T., Blau N., Ramaekers V.T. Effect of antiepileptic drugs and reactive oxygen species on folate receptor 1 (FOLR1)-dependent 5-methyltetrahydrofolate transport. Mol. Genet. Metab. 2010;101:48–54. doi: 10.1016/j.ymgme.2010.05.006. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
15. Lan F., Bayliss P.E., Rinn J.L., Whetstine J.R., Wang J.K., Chen S., Iwase S., Alpatov R., Issaeva I., Canaani E., et al. A histone H3 lysine 27 demethylase regulates animal posterior development. Nature. 2007;449:689–694. doi: 10.1038/nature06192. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
16. Wiles E.T., Selker E.U. H3K27 methylation: A promiscuous repressive chromatin mark. Curr. Opin. Genet. Dev. 2017;43:31–37. doi: 10.1016/j.gde.2016.11.001. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
17. De Santa F., Totaro M.G., Prosperini E., Notarbartolo S., Testa G., Natoli G. The histone H3 lysine-27 demethylase Jmjd3 links inflammation to inhibition of polycomb-mediated gene silencing. Cell. 2007;130:1083–1094. doi: 10.1016/j.cell.2007.08.019. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
18. Stolerman E.S., Francisco E., Stallworth J.L., Jones J.R., Monaghan K.G., Keller-Ramey J., Person R., Wentzensen I.M., McWalter K., Keren B., et al. Genetic variants in the KDM6B gene are associated with neurodevelopmental delays and dysmorphic features. Am. J. Med. Genet. Part A. 2019;179:1276–1286. doi: 10.1002/ajmg.a.61173. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
19. Cao Z., Shi X., Tian F., Fang Y., Wu J.B., Mrdenovic S., Nian X., Ji J., Xu H., Kong C., et al. KDM6B is an androgen regulated gene and plays oncogenic roles by demethylating H3K27me3 at cyclin D1 promoter in prostate cancer. Cell Death Dis. 2021;12:2. doi: 10.1038/s41419-020-03354-4. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
20. Sequeira J.M., Ramaekers V.T., Quadros E.V. The diagnostic utility of folate receptor autoantibodies in blood. Clin. Chem. Lab. Med. 2013;51:545–554. doi: 10.1515/cclm-2012-0577. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
21. Pasini D., Malatesta M., Jung H.R., Walfridsson J., Willer A., Olsson L., Skotte J., Wutz A., Porse B., Jensen O.N., et al. Characterization of an antagonistic switch between histone H3 lysine 27 methylation and acetylation in the transcriptional regulation of Polycomb group target genes. Nucleic Acids Res. 2010;38:4958–4969. doi: 10.1093/nar/gkq244. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
22. Ramaekers V.T., Rothenberg S.P., Sequeira J.M., Opladen T., Blau N., Quadros E.V., Selhub J. Autoantibodies to folate receptors in the cerebral folate deficiency syndrome. N. Engl. J. Med. 2005;352:1985–1991. doi: 10.1056/NEJMoa043160. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
23. Zhang C., Deng X., Wen Y., He F., Yin F., Peng J. First case report of cerebral folate deficiency caused by a novel mutation of FOLR1 gene in a Chinese patient. BMC Med. Genet. 2020;21:2. doi: 10.1186/s12881-020-01162-3. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
24. Pérez-Dueñas B., Toma C., Ormazábal A., Muchart J., Sanmartí F., Bombau G., Serrano M., García-Cazorla A., Cormand B., Artuch R. Progressive ataxia and myoclonic epilepsy in a patient with a homozygous mutation in the FOLR1 gene. J. Inherit. Metab. Dis. Off. J. Soc. Study Inborn Errors Metab. 2010;33:795–802. doi: 10.1007/s10545-010-9196-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
25. Foda B.M., Singh U. Dimethylated H3K27 is a repressive epigenetic histone mark in the protist entamoeba histolytica and is significantly enriched in genes silenced via the RNAi pathway. J. Biol. Chem. 2015;290:21114–21130. doi: 10.1074/jbc.M115.647263. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
26. Agger K., Cloos P.A., Rudkjær L., Williams K., Andersen G., Christensen J., Helin K. The H3K27me3 demethylase JMJD3 contributes to the activation of the INK4A–ARF locus in response to oncogene- and stress-induced senescence. Genes Dev. 2009;23:1171–1176. doi: 10.1101/gad.510809. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
27. Juan A.H., Wang S., Ko K.D., Zare H., Tsai P.-F., Feng X., Vivanco K.O., Ascoli A.M., Gutierrez-Cruz G., Krebs J., et al. Roles of H3K27me2 and H3K27me3 examined during fate specification of embryonic stem cells. Cell Rep. 2016;17:1369–1382. doi: 10.1016/j.celrep.2016.09.087. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
28. Zhang T., Zhang Z., Dong Q., Xiong J., Zhu B. Histone H3K27 acetylation is dispensable for enhancer activity in mouse embryonic stem cells. Genome Biol. 2020;21:45. doi: 10.1186/s13059-020-01957-w. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
29. Marzi S., Leung S.K., Ribarska T., Hannon E., Smith A.R., Pishva E., Poschmann J., Moore K., Troakes C., Al-Sarraj S., et al. A histone acetylome-wide association study of Alzheimer’s disease identifies disease-associated H3K27ac differences in the entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 2018;21:1618–1627. doi: 10.1038/s41593-018-0253-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
30. Yoshitomi R., Nakayama K., Yamashita S., Kumazoe M., Lin T.-A., Mei C.-Y., Marugame Y., Fujimura Y., Maeda-Yamamoto M., Kuriyama S., et al. Plasma homocysteine concentration is associated with the expression level of folate receptor 3. Sci. Rep. 2020;10:10283. doi: 10.1038/s41598-020-67288-9. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
31. Manna S., Kim J.K., Baugé C., Cam M., Zhao Y., Shetty J., Vacchio M.S., Castro E., Tran B., Tessarollo L., et al. Histone H3 Lysine 27 demethylases Jmjd3 and Utx are required for T-cell differentiation. Nat. Commun. 2015;6:8152. doi: 10.1038/ncomms9152. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
32. Northrup D., Yagi R., Cui K., Proctor W.R., Wang C., Placek K., Pohl L.R., Wang R., Ge K., Zhu J., et al. Histone demethylases UTX and JMJD3 are required for NKT cell development in mice. Cell Biosci. 2017;7:25. doi: 10.1186/s13578-017-0152-8. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
33. Satoh T., Takeuchi O., Vandenbon A., Yasuda K., Tanaka Y., Kumagai Y., Miyake T., Matsushita K., Okazaki T., Saitoh T., et al. The Jmjd3-Irf4 axis regulates M2 macrophage polarization and host responses against helminth infection. Nat. Immunol. 2010;11:936–944. doi: 10.1038/ni.1920. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
34. Liu Z., Zhang H., Hu Y., Liu D., Li L., Li C., Wang Q., Huo J., Liu H., Xie N., et al. Critical role of histone H3 lysine 27 demethylase Kdm6b in the homeostasis and function of medullary thymic epithelial cells. Cell Death Differ. 2020;27:2843–2855. doi: 10.1038/s41418-020-0546-8. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Заявление об ограничении ответственности/Комментарий издателя: Все утверждения, мнения и данные, содержащиеся во всех публикациях, принадлежат исключительно конкретному(ым) автору(ам) и соавтору(ам) и не связаны с издательством MDPI и/или его редактором(ами). Издательство MDPI и/или его редактор(ы) слагают с себя ответственность за любой ущерб частным лицам либо собственности, причинение которого может быть связано с любыми идеями, методами, инструкциями либо продуктами, упомянутыми в публикации.